Современная генетика

Современная генетика

оn produc?tori cu profil larg, mai ales ?inвndu-se cont de viteza cu care

ele fabric? produsele. Vom aduce aici urm?toarea compara?ie a lui B.

Neiman: dac? s-ar ini?ia o competi?ie - cine va putea da mai mult?

produc?ie, de exemplu de cea mai valoroas? protein?, comunitatea celulelor

microbiene mici la infinit ?i-ar dovedi cu siguran?? superioritatea fa?? de

un taur.

Aducem calculul lui B. Neiman: taurul cu o greutate vie de 300 kg dup? o

zi de оngr??are intens? spore?te оn greutate cu 1,1-1,2 kg, inclusiv cu 20

grame de protein?. 300 kg de celule de drojdii timp de o zi dau un spor de

25-30 mii kg de mas? biologic?, care con?ine II-13 mii kg ^ protein?

digerabil?.

A?a dar, drojdiile acumuleaz? proteina de 100 mii de ori mai repede decвt

organismul unui taur! Iar bacteriile acumuleaz? masa biologic? ?i proteina

оnc? mai repede decвt drojdiile. Dup? componen?a lor chimic? ?i structural?

aminoacizii bacteriilor, drojdiilor, plantelor superioare ?i animalelor

sunt absolut identice. De aceea insuficien?a de lizin?, bun?oar? din

furajul animalelor sau din hrana omului, poate fi compensat? cu lizina

bacteriilor sau drojdiilor. ,

?tiin?a contemporan? a pus оn fa?a industriei de producere a celulelor

vii, a microbiologiei industriale, care оn strвns? alian?? cu industria

biochimic? ?i ingineria genic? formeaz? esen?a noii orient?ri, numit?

biotehnologie - sarcini complicate, de mare r?spundere.

S? examin?m acum оn mod separat unele aspecte ale biotehnologiei.

11.2 Ingineria genic? оn natur?: transforma?ia, transduc?ia ?i conjugarea

la bacterii

Pentru a оn?elege de ce microbii au ocupat un loc atвt de important оn

ingineria genic?, trebuie s? ne familiariz?m m?car оn mod sumar cu metodele

uimitoare ale schimbului de informa?ie genetic?, ce le ofer? natura.

Celula bacterian? se оnmul?e?te prin diviziune simpl?, dup? care dintr-o

celul? se formeaz? dou?, ?i fiecare din ele con?ine cвte un analog propriu

al nucleului - nucleoidul cu ADN. De aceea celula matern?, оnainte de a se

diviza, trebuie s? aib? dou? genome absolut identice, cu alte cuvinte, dou?

molecule de ADN pentru a transmite una din ele celulei-fiice, iar pe

cealalt? pentru a o p?stra pentru ea. Оnainte de diviziune celula matern?

оncepe s? sintetizeze o copie exact? a ADN-ului s?u. Deoarece procesul

оnmul?irii se produce f?r? participarea organismului masculin, celula-fiic?

poate mo?teni numai genele mamei - supersolitare. Ambele celule noi vor

avea garnitura de gene absolut identice.

Va fi bine dac? a?a va continua din genera?ie оn genera?ie? Din cauza

lipsei unor combina?ii ereditare noi selec?ia natural? ar fi r?mas

«?omer?», ?i evolu?ia n-ar fi avut nici o ?ans? de reu?it?.

Pentru a оnfrunta aceste piedici, natura a inventat multe metode, uneori

uimitor de simple, alteori cu adev?rat fantastice.

Оn primul rвnd, trebuie s? ne oprim asupra muta?iilor, adic? a

modific?rilor оn gene, mo?tenite de celulele-fiice. Despre ele am mai

pomenit. Dar probabilitatea muta?iilor este foarte mic?. Afar? de aceasta,

majoritatea lor covвr?itoare poate provoca apari?ia unor caractere ?i

оnsu?iri inutile sau d?un?toare, descenden?a purt?toare de aceste muta?ii

va fi rebutat? pe parcursul selec?iei naturale. Tocmai aici va apare o alt?

descoperire - recombinarea - un mijloc de schimb de informa?ie genetic? оn

lumea fiin?elor invizibile.

Ca exemplu al acestui fapt serve?te capacitatea uimitoare a bacteriilor

de a absorbi din mediul ambiant gene str?ine ?i de a degaja gene proprii.

Acest fenomen se nume?te transformare. Despre el am men?ionat оn leg?tur?

cu studierea naturii factorului care оl provoac?.

Transformarea este larg r?spвndit? printre procario?i оn condi?ii

naturale. Ea se produce ?i оn celulele animalelor.

Cum se produce ea оn cazul transform?rii schimbului de material genetic?

Оn ciclul de dezvoltare a bacteriilor apare periodic o stare specific?,

cвnd peretele celulei devine penetrabil pentru ADN. Celula care se afl? оn

aceast? stare se nume?te celul? competent?, ea poate absorbi din mediul

ambiant o mare cantitate de ADN str?in. Оn acest scop la оnceput ea secret?

o protein? special?, care se fixeaz? de acest ADN, dup? care ADN-ul str?in

este absorbit de celul? asemeni unei frвnghii, care este tras? de un cap?t

al ei.

Ce se оntвmpl? cu ADN-ul absorbit? Aproape jum?tate din el se scindeaz?,

iar partea r?mas? este utilizat? ca surs? pentru noua informa?ie genetic?.

La оnceput sistemele fermentative ale celulei desfac spirala dubl? a ADN-

ului, apoi o descheie ca pe un fermoar ?i taie оn fragmente filamentele de

transmisie ob?inute. Dup? aceasta pe fiecare fragment care con?ine o gen?

«str?in?» se construie?te ca pe o matri?? a doua caten? ?i sectorul

spiralei duble construit astfel se оncorporeaz? оn ADN-ul propriu al

celulei (fig. 24).

La bacterii, spre deosebire de eucario?i, schimbul de blocurile gata de

ADN este posibil nu numai оntre organismele de aceea?i specie, dar ?i оntre

cele de diferite specii, genuri ?i chiar familii, ceea ce conduce la

modific?ri оn salturi a propriet??ilor ereditare.

Cercetarea multilateral? a procesului natural de transformare la bacterii

a deschis calea spre dirijarea eredit??ii microorganismelor, spre ingineria

genetic? ?i biotehnologia modern?.

Transformarea determin? schimbul direct, nemijlocit de blocuri de ADN

оntre bacterii. Dar, dup? cum s-a constatat, natura mai are alte metode de

transmitere a genelor de la o bacterie la alta.

Deseori transportori de gene aparte sau de grupe de gene sunt virusurile

bacteriilor - bacteriofagii. Nu fagii agresivi (virulen?i) care, p?trunzвnd

оn celul? ?i оnmul?indu-se rapid, o devoreaz?, o distrug, o dizolv? ?i,

dup? ce ies din ea, se n?pustesc asupra celorlalte celule. Ace?tia sunt

fagi pa?nici, a?a-zi?ii fagi modera?i.

Dup? ce au p?trunse оn celul?, ADN-ul ?i ARN-ul lor se insereaz? оn

cromozomul bacteriei-gazde ?i se transform? оn profag. Fagul inserat оn

genomul bacteriei (sau care i s-a aliniat) se оnmul?e?te оmpreun? cu el, se

transmite celulelor-fiice ?i se r?spвnde?te оn felul acesta оn popula?ie.

El nu-?i pierde оns? «esen?a sa de lup». Dac? aceste celule nimeresc оn

condi?ii nefavorabile, fagul о?i leap?d? «blana de oaie» ?i distruge celula

ce l-a ad?postit. Separвndu-se de genomul celulei, fagul ia cu dвnsul o

parte din genele acestuia. Fagul moderat, molipsind o alt? celul? ?i

inserвndu-se оn ADN-ul ei, aduce aici atвt genele sale, cвt ?i pe cele

«furate» de la fosta gazd?, modificвnd ereditatea celulei noi. Acest proces

se nume?te transduc?ie (fig. 25).

Cunoscutul geneticiian S. Alihanean a men?ionat c? genele donorului

transdus (adic? transportate de fag) joac? rolul de «pasageri», iar fagul -

de «birjar».

Lipsa la bacterii a оnmul?irii sexuale, caracteristice pentru eucario?i,

p?rea c? trebuie s? complice recombinarea genelor ?i a genomilor, prin

urmare ?i evolu?ia lor. Dar descoperirea la bacterii a factorilor

acromozomici - a plazmidelor, a introdus оn aceste no?iuni rectific?ri

serioase.

Savan?ii au constatat c? plazmidele sunt independente de ADN-ul celulei

?i se pot оnmul?i independent, pot produce propriile copii. Plazmidele

poart? gene care atribuie bacteriilor unul sau cвteva caractere, de exemplu

rezisten?? fa?? de preparatele medicamentoase, capacitatea de a sintetiza

substan?e active biologice ?. a. Plazmida poate, ca ?i fagul, s? se

insereze оn cromozomul bacteriei ?i s? se separe de el. Asemenea fagului ea

las? uneori оn cromozom una sau cвteva gene proprii ?i la plecare duce cu

ea gene ale gazdei. Оn aceste cazuri propriet??ile ereditare atвt ale

celulei, cвt ?i ale plazmidei se pot modifica оn mod sim?itor.

S-a stabilit c? un tip aparte de plazmide, numite plazmide F (prima

liter? a cuvвntului englez «fertilitate»), reconstituie la bacterii un

proces asem?n?tor celui sexual.

Bacteria purt?toare a plazmidei F ob?ine оnsu?iri ale donatorului - ale

organismului masculin. Pe suprafa?a acestei celule se formeaz? vilozit??i

fine. Cвnd se оntвlne?te cu bacteria feminin? care nu con?ine plazmida F

(ea e numit? recipient), bacteria masculin? «se c?s?tore?te» cu ea, se

conjug?, unindu-se cu ajutorul vilozit??ilor tubulare. Pe aceast? punte

prin canalul de vilozit??i acoperit se transmite plazmida F ?i celelalte

plazmide din celula donatorului оn celula feminin?.

Dac? plazmida F s-a оncorporat оn componen?a cromozomului celulei,

lucr?rile se vor desf??ura altfel. Plazmida provoac? ruptura uneia din

cele dou? catene de ADN ale donatorului, dup? care cap?tul liber al

filamentului cu o singur? caten? se transmite prin canalul vilozit??ii

bacteriei feminine, unde pe acest filament se sintetizeaz? оndat? catena

lui complimentar?. Plazmida F parc? оmpinge din spate segmentul ADN al

donatorului spre celula feminin?. Astfel cu ajutorul plazmidei F cromozomul

donatorului sau o parte a lui se transmite celulei recipientului. Ultima

cap?t? caractere noi, care nu-i sunt proprii dar care sunt caracteristice

pentru donator. Astfel se produce amestecul caracterelor ereditare a dou?

celeule diferite. Nu este oare acesta un adev?rat proces sexual? (fig. 26)

Plazmida F, dup? ce a p?truns оn celul?, produce curвnd descenden?a sa.

Celula feminin?, devenind st?pвn? a acestei plazmide, ce transform?

imediat оn donator ?i, venind оn contact cu alte celule feminine, le

transmite factorul F ?i celorlalte plazmide, de exemplu plazmida R.

Plazmida R (R-prima liter? a cuvвntului «rezistent») transmite bacteriilor

imunitatea pentru antibiotice ?i pentru preparate medicamentoase.

R?spвndirea fulger?toare a acestor plazmide prezint? un mare pericol, c?ci

chiar cele mai eficiente mijloace de combatere a bolii infec?ioase devin

inactive. Оn asemenea cazuri trebuie schimbat de urgen?? medicamentul.

Interesant este c? оn condi?ii naturale plazmidele R se оntвlnesc mai des

la bacteriile patogene, contra c?rora medicii duc o lupt? permanent?. Prin

urmare, utilizarea larg? a antibioticelor contribuie la selectarea unor

bacterii, ce con?in plazmida R, rezistente la aceste antibiiotice.

Bacteriile manifest? caractere de mare valoare оn lupta pentru existen??

оn condi?ii extremale. Oare nu este aceasta o adev?rat? inginerie genic?,

care are loc оn natur??

Toate aceste unelte ?i subterfugii fine, elaborate de lumea microbilor pe

parcursul luptei crвncene pentru existen??, trebuie оnsu?ite pentru a-i

sili pe muncitorii microlumii s? ac?ioneze spre binele omenirii.

11.3 Ameliorarea microorganismelor

Separarea din natur? a unor noi tulpini de microorganisme prezint? doar

prima etap? a muncii de selec?ionare. Sarcina ulterioar? const? оn

ridicarea gradului de calificare a acestor microbi. Savan?ii caut? s?

оn?eleag? nu numai tehnologia proceselor de sintez? ?i de metabolism din

celulele microbiene, dar ?i s? descopere posibilit??ile de ameliorare, de

perfec?ionare, de modificare a eredit??ii cu ajutorul acestei tehnologii.

Оn prezent industria microbiologic? utilizeaz? mii de tulpini ale multor

sute de specii. Ele au fost izolate de sursele naturale ?i ameliorate prin

intermediul mutagenezei induse ?i selec?iei ulterioare a caracterelor

utile. Pentru antrenarea poten?ialului genetic al unui num?r tot mai mare

de microorganisme, la construirea tulpinilor industriale sunt utilizate

atвt microorganismele «de model», cвt ?i tulpinile folosite оn industria

microbiologic?.

Оn calitate de model de baz? se utilizeaz? cunoscutul bacil coli,

mul?umit? c?ruia biologia molecular? modern? a atins ni?te culmi

nemaiv?zute; de el ?in ?i primele succese importante оn domeniul

biotehnologiei ?i ingineriei genice.

Exist? tulpini de bacili coli produc?tori de hormoni (somatostatin?,

somatotropin?, insulin? ?. a.), de aminoacizi (treonin?, prolin?,

homoserin? ?. a.), de diferi?i interferoni ?. a.

Printre tulpinile utilizate оn industria microbiologic? men?ion?m оn

primul rвnd drojdiile, bacilii, ciupercile inferioare, actinomicetele ?. a.

Ele toate produc substan?e variate de mare valoare biologic?. Men?ion?m c?

оn prezent 70% din antibiotice se produc numai cu ajutorul actinomicetelor.

Este cea mai mare subramur? a industriei microbiologice mondiale, care

aduce un venit anual de 8-9 miliarde de dolari.

Bacteriile de genul pseudomonas con?in plazmide purt?toare ale genelor

degrad?rii biologice a compu?ilor organici, inclusiv a acelora care nu se

оntвlnesc оn natur? (de exemplu, pesticidele), fapt ce deschide mari

perspective оn utilizarea lor pentru protec?ia mediului ambiant.

Selectarea tulpinilor de microorganisme cu оnalt? productivitate a

ob?inut оn unele decenii mari succese pe baza realiz?rilor multor ?tiin?e.

Geneticiienii ?i selec?ionatorii, utilizвnd pentru provocarea muta?iilor

mutagenele chimice ?i radia?iile ionizate, au ob?inut noi tulpini care

оntrec ca productivitate de 100 ?i chiar de mai multe ori formele ini?iale.

Dac? penicilina a devenit оn prezent accesibil? fiec?ruia, aceasta se

explic?, оn primul rвnd, prin faptul c? selec?ionatorii au crescut o

cultur? de microorganisme cu o capacitate de 20-25 mii de unit??i la un

mililitru cub de mediu, оn loc de 100 de unit??i, ob?inute la tulpinile

ini?iale. Conform opiniei lui S. Alihanean, aceasta оnseamn? c? оn loc de

200 de fabrici de penicilin? este destul s? avem doar una singur?.

Prin metoda conjug?rii la pseudomonade a fost realizat? cu succes

transferarea genelor ?i construit? o tulpin? ce are drept surs? de carbon

unul din cei doi componen?i ai «substan?ei de oranj» - un defoliant toxic

pentru oameni, folosit pe larg de SUA оn r?zboiul din Vietnam. Aducem оnc?

un exemplu despre geneticiienii ?i selec?ionatorii care оn colaborare cu

inginerii genici «domesticesc» microbii ?i creaz? pentru industrie noi

tulpini cu caractere proiectate. Este vorba despre crearea de c?tre

savan?ii Institutului de cercet?ri ?tiin?ifice оn domeniul geneticiii ?i

selec?iei microorganismelor industriale (IUC?) a unei tulpini noi de

bacterii produc?toare de treonin?.

Treonina, la fel ca ?i lizina, este necesar? pentru оmbog??irea

nutre?urilor ?i produselor alimentare. Aminoacizii lizina, metionina,

treonina ?i izoleucina, оn ordinea оn care sunt prezentate aici, sunt

sintetizate de bacterii din acid asparagic. Aici se respect? ordinea

urm?toare: ca s? oprim sinteza, de exemplu, la etapa de lizin?, trebuie s?

оnchidem drumul pentru transform?rile continue ale acidului asparagic оn

metionin?, treonin? ?i izoleucin?. ?i atunci оn bacterie оncepe

suprasinteza, adic? producerea accelerat? a lizinei. Iar dac? este nevoie

de reducerea intens? a treoninei, trebuie blocat? transformarea ei continu?

оn izoleucin?.

Speciali?tii IUC? оn domeniul geneticiii microorganismelor, оn frunte cu

directorul s?u V. Debabov, au ales pentru efectuarea cercet?rilor lor

colibacilul de care ?in multe din succesele ob?inute оn ingineria genetic?.

Sectorul ADN al acestei bacterii, responsabil pentru sinteza treoninei

(acest sector poart? numele de operon), este compus din trei gene ?i din

regiunea reglatoare care le dirijeaz?. Acest operon codific? formarea a

patru fermen?i care transform? succesiv acidul asparagic оn treonin?, iar

apoi оn izoleucin?.

Cu pre?ul unor mari eforturi savan?ii au reu?it s? provoace muta?ii ale

genelor operonului, datorit? c?rora celulele mutante au оncetat a sintetiza

izoleucina, acumulвnd astfel mai mult? treonin?.

Dar ?i aceste celule sintetizau foarte pu?in? treonin?. Atunci оn ele a

fost inserat cu ajutorul fagului o gen? special?, al c?rei produs activiza,

la rвndul s?u, munca genelor responsabile pentru sintetizarea treoninei.

Dup? efectuarea acestei opera?ii celulele colibacilului au оnceput s?

elaboreze cвte 2-3 grame de treonin? la un litru de lichid cultural.

Оnceputul promitea multe, cu toate c? pentru a fi bun? pentru produc?ia

industrial? tulpina trebuia s? produc? cel pu?in de 10--15 ori mai mult

aminoacid de acest fel.

Ce se putea face? ?i aici speciali?tii ?i-au concentrat aten?ia asupra

uneia din particularit??ile foarte importante ale plazmidelor, care,

p?trunzвnd оn bacterie, оncepe s? se reproduc? repede ?i formeaz?, de

obicei, 15-20 de copii. Dac? оns? оn mediul cultural se introduce ?i

cloramfenicolul, оn celul? se opre?te sintetizarea proteinei ?i spore?te

brusc num?rul de copii ale plazmidei. Uneori ele ating cifra de 3000.

Tocmai acest fapt le-a sugerat savan?ilor cum s? procedeze оn acest caz.

Ini?ial, cu ajutorul fermen?ilor respectivi, ei au t?iat din cromozomul

tulpinii de bacterie ob?inute оnainte un fragment de ADN, care con?inea un

operon de tulpin? cu toate cele trei gene ale sale ?i cu sectorul de

reglare. Dup? aceasta, оn laboratorul de inginerie genic?, operonul a fost

inserat оntr-o plazmid?, iar ea - оntr-o alt? bacterie de aceea?i tulpin?.

Plazmida hibrid? s-a оnmul?it acolo ?i a intensificat sinteza treoninei. Оn

48 de ore de fermentare aceast? nou? tulpin? sintetiza aproape 20 grame de

treonin? la un litru de lichid cultural, iar cвnd au fost ameliorate

condi?iile de cultivare a tulpinii, оn 30 de ore au оnceput s? se acumuleze

aproape 30 de grame de treonin?.

Astfel a fost creat? pentru оntвia oar? оn lume o tulpin? industrial? de

microorganisme, care sintetizeaz? treonina, unul din aminoacizii cei mai

importan?i pentru cre?terea animalelor. Pentru оntвia oar? оn lume aceast?

tulpin? a fost ob?inut? printr-o metod? de construire a ingineriei genice

numai оn trei ani; separarea unor noi tulpini prin metodele tradi?ionale de

selectare dura zeci de ani.

11.4 Industria ADN ?i biotehnologia

Pe parcursul ultimilor ani ia na?tere o nou? ramur?, absolut nou?, de

produc?ie material? - biotehnologia, care utilizeaz? procesele ?i sistemele

biologice pentru a ob?ine cele mai diverse produse.

Oamenii au оnsu?it unele metode biotehnologice оnc? din timpurile

str?vechi. ?i procesele de fermenta?ie care permit ob?inerea produselor

acidolactice, pвinii, o?etului ?. a. fac parte din domeniul biotehnologiei.

Оn ultimele dou?-trei decenii, datorit? schimb?rilor radicale ce s-au

produs оn ?tiin?a biologic?, s-a ridicat la un nivel calitativ nou ?i

biotehnologia. Datorit? acestor realiz?ri omul poate azi nu numai s?

foloseasc? microorganismele «gata», dar ?i s? modifice programul genetic al

celulelor lor, s? le imprime caractere cu totul noi: tocmai оn aceasta din

urm? const? sarcina ingineriei genetice moderne.

Datorit? dezvolt?rii biologiei moleculare ?i ingineriei genice,

biotehnologia a devenit o metod? universal? de ob?inere оn orice propor?ii

a celor mai diverse substan?e organice, permi?вndu-ne s? renun??m la

procesele tehnologiei chimice care-s voluminoase ?i deseori pu?in eficace.

Savan?ii ?i-au concentrat aten?ia оn primul rвnd asupra problemelor de

sintez? a hormonilor, care, al?turi de vitamine, servesc drept reglori de

mare importan?? ai metabolizmului ?i ai multor procese fiziologice din

organismul omului ?i animalelor.

Moleculele hormonilor au dimensiuni mici. Structura multor dintre ele a

fost studiat? detaliat, dar sinteza lor chimic? s-a dovedit a fi prea

dificil? ?i scump?. Deaceea savan?ii au ales оn acest scop o alt? cale:

sintetizarea prin metod? chimic? nu a proteinei-hormon, ci a unei gene

incomparabil mai simple care codific? sintetizarea hormonului necesar. Dar

pentru aceasta gena trebuie inserat? оn componen?a moleculei recombinante

de ADN ?i, sub comanda ei, s? se organizeze оn bacterie sinteza biologic? a

unui hormon uman de valoare complect?.

Pentru prima dat? a fost creat? prin metoda aceasta tulpina bacteriilor -

produc?toare de somatostatin?. Acest hormon este produs de lobul anterior

al hipofizei ?i regleaz? secre?ia unei serii de al?i hormoni, inclusiv a

hormonului cre?terii, insulinei ?i glicogenului. Somatostatina utilizat? оn

practica medical? se ob?ine din hipofiza vitelor cornute mari. Оns? din

punct de vedere chimic ea se deosebe?te оntrucвtva de hormonul amului ?i de

aceea nu d? оntotdeauna rezultatul dorit.

Molecula somatostatinei este compus? din 14 aminoacizi. Un grup de

experimentatori de la Universitatea din California (SUA), оn frunte cu G.

Boyer, au sintetizat o gen? оn care a fost codificat? formarea

somatostatinei. Apoi cu ajutorul plazmidei savan?ii au inserat aceast?

gen? оntr-un colibacil. Оntr-un timp scurt bacteria a sintetizat un volum

mic de lichid cultural ce con?inea o cantitate de hormoni care, de obicei,

se extrage din hipofiza a sute de mii de tauri.

Somatostatina a g?sit de acum o larg? aplicare la tratamentul bolilor

pancreasului (pancreatitelor ?i diabetului), precum ?i a acromegaliei -

cre?terea ne propor?ional? a p?r?ilor proeminente ale corpului. Aceasta a

fost o mare victorie a ingineriei genice. Astfel a devenit real?

posibilitatea de a se ob?ine gene artificiale pentru ceilal?i hormoni ?i de

a deschide perspective ademenitoare pentru producerea celor mai diferite

proteine, precum ?i a altor produse. Aceste produse pot fi ob?inute оn

cantit??i nelimitate, ele vor fi ieftine ?i, ceea ce este ?i mai important,

ac?iunea lor nu se va deosebi de cea a hormonilor omului ?i a altor compu?i

biologici activi.

Оn lobul anterior al hipofizei omului ?i animalelor se sintetizeaz? оn

afar? de somatostatin? un оntreg buchet de hormoni de natur? proteic?,

printre care cel mai cunoscut este hormonul cre?terii sau somatotropina.

Dac? organismul оn cre?tere duce lipsa lui, apare nanismul, iar dac? оl

con?ine оn cantit??i prea mari, apare gigantismul. Despre participarea

acestui hormon la reglarea cre?terii s-a aflat оnc? la оnceputul secolului

XX. Оn anul 1921 cu ajutorul extractului hipofizei au fost crescu?i ni?te

?obolani gigan?i.

Hormonul cre?terii se con?ine оn hipofizele animalelor cornute mari ?i s-

ar putea extrage оn cantit??i necesare. Dar s-a constatat c? somatotropina

este un hormon specific pentru fiecare specie: оn organismul uman

somatotropina animalelor cornute mari nu este activ?. Omul are nevoie de

somatotropina omului. Numai organismul ?obolanilor reac?ioneaz? la

somatotropina «str?in?» ca la cea «proprie».

Un grup de savan?i sub conducerea academicianului A. A. Baev, bazвndu-se

pe experien?a ob?inerii somatotropinei prin metodele ingineriei genice, s-a

apucat de sintetizarea somatotropinei pe cale microbiologic?. Ei ?tiau c?

pentru a sili colibacilul s? produc? somatotropina оn ADN-ul lui trebuie

inserat? o gen? care va dirija sintetizarea acestei proteine оn hipofiza

omului. Оn principiu aceasta se poate realiza, deoarece codurile genetice

ale omului ?i bacteriei sunt similare; aparatul biosintetic al celulei

bacteriene, оn?elat de aceast? asem?nare exterioar?, va produce proteina

de care n-are nevoie, la fel precum p?s?rile оn?elate clocesc pui de cuc.

Scopul era urm?torul: din celulele hipofizei trebuia ob?inut? o gen?,

care ar fi dirijat sinteza somatotropinei. Celula care sintetizeaz? activ

proteina urma s? con?in? numaidecвt o cantitate sporit? de ARNi, o copie a

genei preg?tit? parc? de оns??i celula care codific? succesiunea

aminoacid?. Acest proces biosintetic furtunos se produce оn celulele

tumorale ale hipofizei; o p?rticic? de ?esut tumoral cu o greutate de mai

pu?in de un gram a servit drept material ini?ial pentru ob?inerea genei de

somatotropin?.

Оn urma unor numeroase ?i foarte fine opera?ii de separare a genei din

p?rticica de hipofiz? a r?mas o cantitate infim? de ARNi. A dispune de

solu?ia pur? de ARNi, оnseamn? a avea o copie a genei, iar gena mai trebuia

preg?tit? оn corespundere cu copia. Оn acest scop s-a folosit un ferment

special numit revertaz? (trancriptaz? invers?), care ia automat o copie a

ARNi.

ADN-ul ob?inut este compus din catene unice, оn timp ce оn gen? fiecare

caten? de ADN trebuie s? fie unit? cu catena ei complimentar?. Opera?ia de

sintetizare a acestei catene complimentare o efectueaz? automat cunoscutul

ferment ADN - polimeraza 1.

Astfel preparatul care con?ine gena de somatotropin? nimere?te оn

eprubet?.

Sarcina urm?toare, care se afla оn fa?a experimentatorilor, consta оn

оnmul?irea acestei gene pвn? la ob?inerea unei cantit??i suficiente pentru

munca continu?. Оn acest scop era nevoie, оn afar? de fermen?i, de оnc? un

instrument universal ob?inut prin distrugerea оnveli?ului celulelor

colibacilului ce con?ine plazmide libere. Dup? tratarea plazmidelor cu

fermentul restrictaza care scindeaz? molecula de ADN оn sectoare strict

determinate, inelele plazmidei se desfac, transformвndu-se оn catene

liniare. Restrictaza are capacitatea de a face ca la polii moleculei rupte

de ADN s? apar? sectoare «lipicioase», formate din dou? catene

complimentare deschise, оns? dac? ?i gena separat? va fi оnzestrat? cu

asemenea poli «lipicio?i», plazmida, оnchizвnd inelul ei, va prinde cu

ajutorul lor ?i garnitura suplimentar? - gena somatotropinei. Anexarea

polilor «lipicio?i» de gena separat? este una dintre cele mai fine opera?ii

ale ingineriei genice. La оnceput pe cale pur chimic? se sintetizeaz? un

mic fragment de ADN, care reproduce cu exactitate succesivitatea

nucleotidelor capabile s? fie scindate de restrictaz?, apoi cu ajutorul

fermentului ligaza acest fragment de ADN este suturat de ambii poli ai

genei. Urmeaz? tratarea produsului cu restrictaz? ?i gena cu polii

«lipicio?i» este gata. Dac? aceast? gen? este amestecat? cu plazmidele

fragmentate ?i acest amestec este tratat cu ligaz?, toate rupturile se vor

uni ?i оn epruveta noastr? vom ob?ine nu o simpl? gen?, ci o gen? inserat?

оntr-o plazmid?.

Plazmida singur? nu este bun? pentru nimic. Dar dac? va nimeri din nou

оntr-o bacterie, ea va оnmul?i ?i gena inserat? оn ea. A?a c? gena de

somatotropin? se poate ob?ine оn orice cantit??i necesare. Ce urma s? se

mai оntвmple? Doar gena pe care am ob?inut-o deocamdat? «tace»: cu toate c?

se оnmul?e?te оmpreun? cu bacteriile, ea nu func?ioneaz?, nu d? comanda de

sintetizare a proteinei pe care o codific?. C?ci pentru a оncepe «s?

vorbeasc?», gena trebuie оnzestrat? cu elemente de semnalare, care induc

transcrierea (sinteza ARNi) ?i translarea (sinteza proteinei оn ribosome).

Оn acest scop din plazmidele colibacilului a fost separat fragmentul ADN

- promotor, care semnaleaz? necesitatea de a оncepe citirea informa?iei ?i

de a se sutura cu gena somatotroninei. Aceast? gen? capabil? de munc? a

fost din nou inserat? оn plazmide, iar plazmidele - оncorporate оn

bacterii, оnzestrвndu-le cu capacitatea de a sintetiza hormonul cre?terii.

Aceast? parte finala a fost numit? expresia genei.

Astfel colibacilul reconstruit a devenit un produc?tor extrem de activ de

somatotropin? a omului. Dintr-un litru de cultur? de bacterii ast?zi se

separ? atв?ia hormoni ai cre?terii, cвt s-ar fi putut ob?ine din cincizeci

de hipofize.

Оn schema descris? au fost omise multe opera?ii esen?iale. Am оncercat

doar s? reprezent?m aici оntr-o forma cвt mai simpl? munca enorm? ?i extrem

de fin?, оn care a fost antrenat un colectiv de savan?i pentru a separa

genele, a le modifica, amplifica (оnmul?i) ?i a le schimba expresia оn

celule str?ine cu scopul de a ob?ine anumite preparate medicamentoase.

Ne-am oprit inten?ionat mai detaliat asupra descrierii opera?iilor

principale de creare a somatotropinei prin metodele ingineriei genice

pentru a evita mai apoi repet?rile, deoarece aceste opera?ii sunt comune ?i

la sintetizarea altor compu?i activi d. p. d. v. biologic.

Оn realitate opera?iile ingineriei genice se reduc la crearea dintr-o

garnitur? de fragmente de ADN inactive a unei noi structuri genetice - a

unei molecule recombinate de ADN activ? d. p. d. v. fiziologic ?i care se

includea оn activitatea vital? a celulei. Din aceste considerente оn

deceniul al optulea оn ??rile dezvoltate au ap?rut firme speciale, care au

elaborat procese industriale bazate pe tehnologia ADN-ilor recombinan?i.

Aceast? nou? ramur? a industriei biologice a fost numit? industria ADN-

ului.,

La оnceput marile centre ?tiin?ifice ?i-au limitat activitatea la

ingineria genetic? a microorganismelor, mai tвrziu au оnceput a se ocupa

paralel cu ingineria genetic? a plantelor, animalelor, precum ?i cu

ob?inerea de anticorpi monoclonali.

Ingineria genic? ?i ingineria celular?, care se dezvolt? paralel cu ea,

au l?rgit posibilit??ile biotehnologiei ?i industriei bazate pe procesele

biologice. A devenit posibil? folosirea celulelor microbiene, vegetale ?i

animale, precum ?i a moleculelor ?i genelor sintetice. Despre acestea se va

vorbi оn capitolele urm?toare.

XII. INGINERIA GENETIC? LA PLANTE

12.1 Clonarea plantelor

Dac? vom оnfige оn p?mвntul umed o crengu?? de salcie sau de plop, ea va

da r?d?cini, va cre?te ?i se va transforma оntr-un copac falnic. Dintr-un

«ochi» de tubercul de cartof se poate ob?ine o tuf? de cartofi. Poate oare

o singur? celul? pune оnceputul unei plante?

Оnc? nu demult aceast? оntrebare ?inea de domeniul fantasticii. Biologii,

оns?, au r?spuns afirmativ la ea, iar experimentatorii au оnv??at s?

creasc? оn medii nutritive celule aparte, care devin organisme

monocelulare: tr?iesc, se divizeaz?, sporindu-?i descenden?a, dar r?mвn

celule aparte. P?rea c? experien?ele au menirea s? satisfac? un interes

teoretic. Savan?ii c?utau, bun?oar?, s? clarifice: ce deosebire exist?

оntre celulele ce formeaz? ?esuturile plantei оntregi ?i celulele separate,

care tr?iesc «liber»?

O mare importan?? оn acest sens a avut-o descoperirea c? celulele ce

tr?iesc liber se transform? оn anumite condi?ii оntr-o plant? оntreag?.

Aceast? descoperire a trasat c?i noi pentru cunoa?terea legit??ilor de

dezvoltare a organismului pluricelular. Chiar la prima etap? a cercet?rilor

au fost proiectate perspectivele aplic?rii оn practic? a acestor

propriet??i ale celulelor.

Celula izolat? ?i cultivat? оn eprubet? cu mediul nutritiv artificial,

dup? o serie de diviziuni, este capabil? s? pun? оnceputul tuturor

organelor vegetative ?i generatoare ale plantei. A devenit clar c? orice

celul? specializat? con?ine оntreaga garnitur? de gene, care codific?

dezvoltarea ei оn orice direc?ie ?i, оn cele din urm?, transformarea ei оn

plant?. O asemenea celul?, cu toate c? a ap?rut оn urma diviziunii

celulelor somatice (asexuate), seam?n? ca func?ie cu ovulul fecundat sau

zigotul. Despre aceste celule se spune c? sunt totipotente, adic? au

capacitatea poten?ial? de a se dezvolta оn orice direc?ie.

Fenomenul transform?rii celulei оntr-o plant? оntreag? a fost numit

embriogenez? somatic? оn cultura ?esutului. Ea poate fi observat? bine оn

epruveta cu cultura ?esutului de morcov. Aici, оn masa de celule omogene,

apare treptat o celul? ce оncepe s? se transforme оntr-o celul? zigotiform?

tipic? cu un nucleu m?rit. Оn continuare diviziunea ia contururile

germenelui din ovarul florii. Dar aici n-avem оnc? nici floare, nici

plant?, iar germenele оnconjurat de celulele callus nu se afl? оn sol, ci

оn eprubet?. Ea trece toate fazele principale ale dezvolt?rii sale: se pun

bazele viitoarei r?d?cini necesare pentru cre?terea tulpinii, mugurelui ?i

totodat? a primelor frunze, cu cotiledoane.

Оn aceast? etap? germenele poate fi separat din ?esutul callus ?i a?ezat.

оntr-un mediu f?r? hormoni, deoarece acest mic organism vegetal poate s?-i

sintetizeze singur. El оncepe repede s? formeze sistemul radicular, apoi

frunzele sectate tipice pentru morcov. Dac? aceast? plant? minuscular? o

vom s?di оn sol, ea va pune оnceputul unei plante normale, ce formeaz? o

r?d?cin? ?i o rozet? de frunze. Mai tвrziu va apare, ca la orice plant?

bienal?, o tulpin? florifer? ?i va оnflori.

Bineоn?eles, posibilitatea de a cre?te o plant? оntreag? dintr-o celul?

ne fecundat? este o mare realizare ?tiin?ific?. Acest fenomen este utilizat

cu succes la crearea unor soiuri noi, la оnmul?irea unui exemplar

interesant, de exemplu оn floricultur?. Aici avem posibilitatea s? nu

a?tept?m pвn? cвnd vor apare ?i vor cre?te semin?ele, ci s? ob?inem

materialul celular necesar ?i s? cre?tem din el оntr-un termen scurt un

num?r mare de flori noi, identice cu exemplarul primar.

Aceast? metod? poart? numele de clonarea plantelor. Ea este folosit? pe

larg la cre?terea plantelor care nu con?in virusuri. Exist? sute de specii

de virusuri vegetale. Ele nu sunt periculoase pentru om, dar aduc daune

mari, pentru c? reduc productivitatea culturilor agricole. Virusurile atac?

mai alee plantele care se оnmul?esc prin tuberculi, buta?i ?i bulbi. Numai

cartoful este afectat de aproape 20 de virusuri. Din cauza lor pierderile

ajung pвn? la 20—30% din recolt?. Оn fiecare an se pierd milioane tone de

produc?ie. Ob?inerea cartofului avirotic spore?te recolta lui cu 80 de

procente.

A fost elaborat? o serie de metode de cultivare a culturilor celulare

vegetale ?i de cre?tere a unor plante оntregi din celulele mugurilor

terminali sau ale vвrfurilor r?d?cinilor — ale p?r?ilor lipsite de

virusuri. Оn felul acesta se face asanarea contra virusurilor materialului

s?ditor al cartofului, vi?ei-de-vie, c?p?unei, zmeurii, florilor ?. a.

Experien?ele au demonstrat c? de la vвrful unui l?star se pot ob?ine repede

zeci de mii de germeni. Dintr-o singur? celul? a vвrfului de l?star al

vi?ei-de-vie, bunzoar?, peste trei-patru s?pt?mвni se ob?in cinci germeni

care se apuc? ?i ei «de lucru» ?i dau noi germeni. De acum din primul model

de plant? nou? se ob?in оn felul acesta mii de exemplare. Astfel cu

ajutorul epruvetei, f?r? folosirea cвmpului ?i a pepinierei, se pun bazele

substituirii rapide a soiurilor perimate.

La fel de actual? este trecerea la plante avirotice оn pomicultur?.

Intensificarea acestei ramuri este determinat? оn mare m?sur? de s?direa pe

planta?iile industriale a unui material s?ditor asanat. C?ci ce prezint?

pue?ii avirotici? Ei nu se tem de оng?lbenirea ?i rugozitatea frunzelor, de

pete ?i de adвncituri, formate prin lovire, pe fructe, de оmb?trвnire

rapid? ?. a. Recolta оn livada avirotic? este cu aproape o treime mai mare

decвt cea medie.

La «Codru», asocia?ie ?tiin?ific? de produc?ie din RM, s-a оnsu?it

deprinderea de a ob?ine acest material s?ditor pentru livezile ?i

planta?iile de arbu?ti fructiferi: оn una dintre gospod?riile asocia?iei —

a fost dat оn exploatare un mare complex de pepinier? pomicol?.

Оn Moldova au fost s?dite planta?ii mari de fragi, baza c?rora a fost

pus? оn eprubet?. Este o priveli?te оncвnt?toare s? vezi cum din p?rticica

minuscul? a mugurelui terminal se na?te treptat o tuf? de frag, mic?orat?

de sute de ori. Acest proces, precum ne spune colaboratorul ?tiin?ific N.

Abramenco, seam?n? cu un film cu de-sene animate: la оnceput punctul de

jum?tate de milimetru se transform? оntr-un ghemu?or de culoare deschis?,

apoi se formeaz? frunzuli?e verzi-deschise pe ni?te radicele foarte scurte.

Dup? acesta spa?iul epruvetei este cucerit de un buchet de muguri, strвns

uni?i оntre ei, ?i, оn sfвr?it, apare o miniatur? exact? a cunoscutei

rozete de frunze de frag.

Este un material semincer de mare valoare. Doar virusurile, de regul?,

atac? toate celulele vii ale plantei, dar nu dovedesc s? acapareze ?esutul

tвn?r care se divizeaz? activ оn punctul de cre?tere al l?starului. Planta

care regenereaz? din el este absolut s?n?toas?. Recolta de la aceste

planta?ii de frag spore?te de dou?-trei ori. Tot prin aceast? metod? poate

fi m?rit? mult roada de zmeur, agri?, de culturi sвmburoase ?i semin?oase.

Prin clonare se poate ob?ine nu numai material s?ditor avirotic. Prin

aceast? metod? оn principiu se pot transmite оntregului clon multe alte

caractere utile, bun?oar? productivitate оnalt? a unor exemplare aparte ale

plantei. A?a, оn Nigeria, la Institutul de cercet?ri ?tiin?ifice оn

domeniul cauciucului, au fost separa?i cloni de heveia, care dau 1600—3600

kg de cauciuc la hectar comparativ cu 300 kg cвt se ob?inea de obicei.

J. ?epard, geneticiian american, a ob?inut din celule vegetale separate

ale frunzelor de cartof cloni rezisten?i la una dintre cele mai periculoase

boli ale cartofului — mana cartofului. Оmpreun? cu unul din colegii s?i,

?epard a crescut cloni ai cartofului rezistent contra fitoftorei timpurii.

Оn prezent ei оncarc? «s? creeze» un clon de cartof rezistent la ambele

boli.

Оnmul?irea pe cale vegetativ? a plantelor оncepe s? atrag? tot mai mult

aten?ia selec?ionatorilor, care, prin intermediul ingineriei celulare,

ob?in soiuri noi de plante agricole. Оn primul rвnd sunt aplicate mai pe

larg metodele de ob?inere ?i utilizare a plantelor cu o garnitura unic?

(haploid?) de cromozomi, care accelereaz? ?i u?ureaz? crearea liniilor

hibride nescindabile.

Plantele haploide sunt urma?ii nu a doi p?rin?i, ca de obicei, ci a unui

singur p?rinte. Ele se ob?in de cele mai multe ori din polen — din celula

sexual? masculin?. Asupra ei se ac?ioneaz? cu stimulatori speciali ?i ea

este silit? s? se dezvolte, de parc? ar fi o celul? embrionar? normal?,

ap?rut? оn urma contopirii' celulei masculine cu cea feminin?. De obicei,

copiii mo?tenesc оnsu?irile lor de la tat?l ?i mama, de fiecare dat? оn

propor?ii diferite. Haploizii fixeaz? trainic оnsu?irile valoroase ale

plantei genitoare. Faptul acesta reduce mult termenele de creare a

soiurilor noi. Оn prezent din celulele de polen s-a reu?it s? se creasc?

peste 50 specii de plante haploide, printre care: grвul, secara, orzul,

cartoful, tutunul ?. a. Schema general? de ob?inere a haploizilor este

prezentat? оn fig. 27.

Metoda de ob?inere a plantelor haploide din celulele gametofitului

(polenului) masculin a fost numit? androgenez?.

Cu ajutorul cultiv?rii anterelor sau a polenului оn medii nutritive

speciale, la оnceput se formeaz? a?a-zi?ii embrioizi, iar apoi plantele

haploide.

Uneori оn cultura anterelor nu se formeaz? embrioizi, ci un ?esut

nediferen?iat, numit calus, ?i, numai dup? aceasta, оntr-un mediu nutritiv

specific pentru diferen?iere, din celulele calusului apar plante оntregi.

Ob?inerea plantelor din celule haploide aparte prezint? una dintre cele

mai mari realiz?ri ale ingineriei genice. Ea prezint? o importan?? colosal?

atвt teoretic?, cвt ?i practic?. Astfel plantele haploide, care con?in

numai o singur? garnitur? de cromozomi, manifest? оn fenotip activitatea

tuturor genelor: atвt a celor dominante, cвt ?i a celor recisive. Dac?

anterele sau polenul din care urmeaz? s? fie ob?inute plantele haploide

sunt expuse radia?iei sau tratate cu mutageni chimici, toate muta?iile

induse оn ei se vor manifesta оn prima genera?ie a plantei. Aceasta are o

mare importan??, deoarece majoritatea muta?iilor, de regul?, sunt recisive

?i la plantele diploide se afl? оn stare latent?. Iar la plantele haploide

toate muta?iile utile pot fi separate imediat, iar apoi, оntr-un timp

incomparabil mai scurt, prin diploidizarea acestor plante mutante, se pot

ob?ine noi soiuri de plante culturale cu caractere economice utile.

Ob?inerea haploizilor prin metoda androgenezei ?i utilizarea lor la

selec?ia plantelor are o mare importan??. Оn primul rвnd, pe aceast? cale

se reduce de la 7— 10 pвn? la 1—2 ani timpul necesar pentru ob?inerea

liniilor homozigote. Оn rвndul al doilea, num?rul plantelor experimentale

care trebuie studiate, de regul?, se reduce mult la acest proces. Prin

urmare, volumul total de munc? se reduce brusc ?i ?ansele selec?iei

accelerate, mai exact, a exemplarelor de valoare, sporesc. Aceasta este

principalul оn munca mig?loas? a selec?ionatorului.

Оn ultimul timp se dezvolt? intens o nou? direc?ie оn genetica plantelor

— selec?ia gametic? ?i celular?. La Academia de ?tiin?e a RM a fost creat

un centru interdepartamental de selec?ie gametic? ?i celular?, care va

realiza toate cercet?rile. la nivelul celulei ?i selec?ia prealabil? a

celor mai reu?ite forme recombinate de plante pentru selec?ia continu?.

Оn fa?a colectivului de savan?i se pune o sarcin? dubl?: a l?rgi spectrul

variabilit??ii ereditare a plantelor, apoi a selecta din sursele de gene pe

cele mai de perspectiv?. Prima jum?tate a acestei sarcini savan?ii

moldoveni o realizeaz? pe baza cercet?rilor оn domeniul recombinogenezei —

transmut?rii genelor оn perioada form?rii polenului. Ei reu?esc s? ob?in?

cu ajutorul unor inductori geneticii speciali o mult mai mare variabilitate

decвt chiar dup? efectuarea unor ac?iuni externe puternice: de radia?ie,

chimice, calorice ?. a.

Bogata varietate de genotipuri mai trebuie оns? ?i men?inut?. Acesta este

un lucru foarte anevoios. Mecanismele naturii func?ioneaz? astfel, оncвt

masa principal? de polen cu combin?ri atipice de gene s? nu produc?

descenden??. S-a constatat c? acestui polen i se poate ajuta aplicвnd

substan?e biologic active. La selectarea acestor surse de gene, s-a ?inut

cont de o observa?ie foarte important?, f?cut? de geneticiieni. Dac? оn

perioada poleniz?rii este secet?, gr?uncioarele de polen, purt?toare a

genei rezisten?ei fa?? de ea, au mai multe ?anse de a produce descenden??.

Dac? este foarte frig, se transmit genele rezistente la frig. Astfel se

оntвmpl? aproape cu to?i factorii ne favorabili ai mediului ambiant.

Savan?ii realizeaz? selec?ia artificial? оn camere climaterice speciale,

reproducвnd diferite condi?ii naturale extremale. Оn felul acesta au fost

crescute formele de tomate rezistente la salinizarea solului.

La selec?ia celular? ac?ioneaz? acela?i principiu: la оnceput se induce

variabilitatea, apoi se selecteaz? cele mai reu?ite combin?ri de gene. Dar

aceasta se face de acum cu celulele obi?nuite, care fac parte din anumite

?esuturi ale plantelor — frunza, tulpina, r?d?cina.

Оn prealabil cu ajutorul unor solu?ii chimice speciale ei sunt adu?i оn

stare «de suspensie», adic? celulele оncep s? tr?iasc? separat unele de

altele. Apoi din celule aparte se formeaz? plante оntregi cu caractere

ereditare programate оn prealabil. Astfel savan?ii moldoveni au ob?inut

tomate rezistente la varia?ii considerabile de temperatur?.

12.2 Industria celulelor vegetale

De multe ori celulele care au fost crescute un timp оndelungat оn afara

organismului plantelor о?i men?in capacitatea de a sintetiza substan?ele

active (alcaloizii, hormonii, fitoncizii, uleiul eteric ?. a.), pe care ele

le produc оn plant?. Оnseamn? c? pentru a ob?ine aceste produse de valoare

celulele vegetale pot fi cultivate оn aparate speciale. Astfel, оn

industria microbiologic? ciupercile microscopice ?i bacteriile produc

vitamine ?i antibiotice. Aceasta este deosebit de important оn cazurile

cвnd materia prim? vegetal? necesar? este pu?in accesibil? (plantele

tropicale, speciile rare sau pe cale de dispari?ie) sau se cultiv? greu.

Cultivarea celulelor trebuie s? se foloseasc? оn industrie la fel de larg

ca ?i microorganismele.

Celulele vegetale оns? nu sunt bacterii. Mult timp experien?ele de

cultivare a lor оn medii artificiale e?uau. S-a constatat c? celulele

plantei, care au determinat deja apartenen?a lor la diferitele ei p?r?i,

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15